结核分枝杆菌联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌免疫保护性抗原DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗联合免疫,BCG免疫以及联合DNA疫苗初免-BCG加强免疫等不同的免疫策略,诱导免疫应答效果观察.方法:健康雌性BALB/c小鼠24只,随机分成PBS 阴性对照组,DNA初免-BCG异源加强组,DNA(Ag85A和ESAT-6)初免DNA同源加强组和BCG阳性对照组,共进行3次免疫,初免2次,最后1次加强,间隔2周1次.PBS组3次均注射PBS 溶液;DNA/BCG组以质粒DNA免疫2次,最后1次以BCG加强免疫;DNA/DNA组3次均以质粒DNA进行免疫;BCG组则注射PBS溶液2次后以BCG免疫.末次免疫后4、6、8周分别分离血清测定总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,体外经TB-PPD刺激后进行淋巴细胞增殖实验(XTT法)并测定脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平.结果:DNA/BCG、DNA/DNA、BCG组体外经TB-PPD刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,3组平均效价为1:120、1:160、1:80,DNA/DNA组的抗体效价高于另外2组;小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,其中DNA/BCG组IFN-γ的分泌水平高于DNA/DNA组和BCG组(P<0.05).结论:联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫策略能在小鼠体内诱导较强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ.     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素2(hBD-2)mRNA的表达

目的 :检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞 β 防御素 2基因的激活作用及其活性组分。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法和Northern杂交检测HT 2 9细胞hBD 2mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成份。结果 :RT PCR和Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下HT 2 9细胞无可见的hBD 2mRNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD 2mRNA表达。结论双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD 2基因的表达 ,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性组分。双…     

结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用

目的观察结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白间的相互作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10基因，构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10，经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后，采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109。结果共转染pGBKT7-ESAT-6和pGADT7-CFP-10的酵母菌AH109可以在SD／-Ade／-His／-Leu／-Trp培养基上生长，β-半乳糖苷酶活性实验阳性。结论结核分枝杆菌ESAT-6与CFP-10蛋白可以相互作用。     

赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用

目的对赖型钩端螺旋体Loa22基因进行表达和功能研究。方法构建赖型钩端螺旋体Loa22成熟肽重组质粒,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目标蛋白表达情况。经亲和层析获得目标蛋白并作用于小鼠巨噬细胞ANA-1,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、四氮唑复合物(XTT)吸光度值和细胞凋亡率以评价其细胞毒性。结果成功构建Loa22成熟肽原核表达质粒,通过鉴定并纯化得到Loa22成熟肽,该蛋白使培养ANA-1细胞上清液中LDH活力升高,XTT吸光度值下降,细胞凋亡率增加。结论Loa22对ANA-1具有明显的毒性效性,该基因可能是致病钩体的一个重要毒力相关基因。     

大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选

目的 构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGKINVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础.方法 将invA基因克隆于pGKble24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGKINVA.质粒pGKINVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株.结论 从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGKble24构建重组穿梭质粒pGKINVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在Korthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株.结论 成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGKINVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析.     

赖型钩体毒力相关基因OmpL17表达纯化及其产物的趋化作用

目的研究钩体017株外膜蛋白新基因ompl17与钩体肺大出血的相关性。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA，扩增出ompL17基因，与表达载体pGEX-4T-1重组，诱导表达OMPL17蛋白，然后纯化得到活性表达产物，并建血管基底膜，分析该产物的趋化活性。结果SDS-PAGE和Western-blot分析证实诱导表达并纯化得到OMPL17蛋白，趋化作用分析证明该基因表达产物具有趋化活性。结论成功表达纯化出ompL17基因的蛋白，观察到该基因表达产物具有趋化活性，为赖型钩体的分子机制的进一步阐明奠定了基础。     

结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞成瘤性的抑制作用

目的探索结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对动物体内的肺癌A-549细胞的成瘤性的影响,以及因此产生的对动物免疫功能的作用。方法构建BALB/C小鼠的免疫抑制模型,通过接种稳定表达结核分枝杆菌RelE毒素蛋白、RelB抗毒素蛋白和RelBE毒素-抗毒素蛋白的肺癌A-549细胞株,含空质粒PcDNA3.1（＋）的A-549细胞株,以及正常的肺癌A-549细胞,构建BALB/C小鼠荷瘤模型,观察各组小鼠的肿瘤生长情况,并测定各组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性以及血清IFN-γ和IL-2的浓度。结果接种了表达RelE毒素蛋白的A-549细胞的小鼠组,肿瘤生长较其它实验组慢,肿瘤结节的瘤体体积和数量都较其它实验组有明显差异（P〈0.05）。对各组小鼠免疫功能变化的研究发现,各实验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性以及血清IFN-γ和IL-2的浓度的差异没有统计学意义（P〉0.05）。结论结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞的成瘤性有抑制作用。     

HMGN2分子体外抗乙型肝炎病毒活性研究

目的： 我们先前的研究证明HMGN2（high mobility group nucleosomal-binding domain 2）是人LAK细胞抗菌的一个新的效应分子,本研究欲检测其体外抗乙型肝炎病毒的活性。方法: 应用反向高效液相色谱技术从人淋巴结组织酸溶性提取物中分离纯化批量HMGN2分子,用质谱精确分子量测定、Western blotting和抗菌试验对分离纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。采用MTT法检测HMGN2分子对稳定转染复制型HBV重组质粒的肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞的细胞毒性;用不同浓度HMGN2分子作用于HepG2.2.15细胞,分别在第3 d和第6 d收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBV DNA的含量。结果: 从人淋巴结组织中分离纯化获得纯度较高的HMGN2蛋白;在检1-100 mg/L范围内,HMGN2分子对HepG2.2.15细胞无细胞毒性;HMGN2分子在1-5 mg/L水平即可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,可显著降低HBV DNA拷贝数。结论: HMGN2分子在体外具有较强的抗HBV活性。     

HMGN2对大肠埃希氏菌TA系统的作用

目的研究HMGN2对大肠埃希氏菌TA系统作用。方法用5％高氯酸萃取兔胸腺组织,通过反相高效液相色谱进一步分离纯化蛋白,用Tricine-SDS-PAGE、AU-PAGE和Dot-blot进行鉴定。采用凝胶迁移阻滞试验（EMSA）检测HMGN2对大肠埃希氏菌TA系统的结合作用;平板菌落记数法检测TA系统激活或非激活条件下,菌体过表达重组HMGN2和对照组对细菌存活百分率的影响。结果HMGN2可阻滞mazEF基因的泳动速率,且随HMGN2浓度增加,阻滞作用增强。利福平激活TA系统,菌体过表达重组HMGN2后,与对照组比较细菌存活量减少约30％,有统计学差异。而头孢哌酮不能激活TA系统,过表达重组HMGN2组和空质粒组CFU％分别为70．2％、68．9％,两者无明显差异。结论HMGN2可加强mazEF系统介导的细菌程序性死亡;HMGN2对TA系统的作用也可能是其抗大肠埃希氏菌作用的机制之一。     

结核杆菌检测基因芯片的制备研究

目的　建立结核杆菌检测基因芯片的制备技术。方法　制备和标记靶基因 ,用点样仪将靶基因点于玻片介质上 ,并经点样后处理制成基因芯片 ,用扫描仪测定处理前后芯片上荧光强度的变化 ,计算 DNA固定率 ,同时测定和比较两种不同玻片、不同点样液和三种不同点样后处理方法的 DNA固定率。结果　制备结核杆菌检测基因芯片 ,用醛基修饰玻片作为介质 ,用 DMSO溶液作为点样液 ,点样后芯片处理以水合 1小时再干燥 30分钟为佳。结论　本研究所建立的结核杆菌检测基因芯片制备技术具有较高的效率和可靠的实用性能